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項目介紹

WB（Western Blot，蛋白質(zhì)印跡法）實驗是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的特性來檢測特定蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)?；驹硎墙?jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

樣品要求

1、新鮮樣品：1、100mg（至少）新鮮組織，干冰運輸；

2、細(xì)胞：細(xì)胞類型樣本細(xì)胞數(shù)為1-2*10⁷以上，收集細(xì)胞后PBS清洗三遍，離心去除上清，干冰運輸；

3、血液樣品：樣品無潛在性攜帶病原體和病毒。如果存在病毒的可能性，請滅活處理；

（1）全血：采集新鮮血液，建議全血樣品用全血樣品RNA提取試劑盒抽提RNA，或者新鮮血液分離白細(xì)胞；處理后的樣本放入干冰或者﹣80℃冰箱保存，干冰運輸寄送。

（2）血漿：用EDTA等抗凝劑處理后的樣本，4℃ 4000rpm離心5分鐘，上層為血漿樣本，按每200μl血漿樣本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運輸寄送。

（3）血清：用非抗凝管收集血樣，靜置分離上層血清，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，渦旋搖勻，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰運輸寄送。

4、蛋白樣品：未變性的蛋白需要存入-80°C ，干冰運輸寄送；Loading Buffer煮沸的蛋白，需要提供蛋白濃度(濃度需在5μg/μl 以上，200μl樣品)，冰袋運輸寄送。

5、植物組織樣品：選取新鮮組織，200mg以上組織，盡量避免衰老，病變，發(fā)霉的組織；將樣品剪成小塊放入液氮預(yù)冷的螺口離心管中，在液氮中速凍5min，-80度保存，干冰運輸寄送。

6、菌體：收集菌體到1.5ml的離心管內(nèi)，離心去上清，用1*pbs洗滌三次，液氮速凍5min后，-80度保存。

項目案例

常見問題

1、1、為什么蛋白質(zhì)印跡條帶大小與預(yù)期的不同？

答：蛋白質(zhì)印跡是一種基于蛋白質(zhì)大小來分離蛋白質(zhì)的技術(shù)。一般來講，蛋白質(zhì)越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實際條帶大小可能與預(yù)測的不同。

常見的因素包括：

1.翻譯后修飾：例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白質(zhì)大小。

2.翻譯后切割：例如許多蛋白先被合成為前蛋白，然后被切割產(chǎn)生活性形式，例如前半胱天冬酶。

3.剪接變體和異形體：可變剪接和異形體可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。

4.相對電荷-氨基酸（帶電和不帶電）多聚體組分，例如蛋白質(zhì)的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止，但強相互作用會導(dǎo)致較大的條帶出現(xiàn)。

2、2、蛋白樣本為什么要進行還原和變性？

答：為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來打破蛋白的高級結(jié)構(gòu)，變成初級的氨基酸結(jié)構(gòu)，同時以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì)，使其帶上負(fù)電荷。這一恒定的負(fù)電荷比是下一步凝膠電泳分離的關(guān)鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來斷開蛋白自身的二硫鍵，進一步使蛋白質(zhì)變成線性結(jié)構(gòu)，此圖中簡單地展示了這一過程。順便提一下，有些抗體只能夠識別目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性。所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進行。

3、3、為什么檢測重組蛋白時難以獲得條帶？

答：抗體檢測重組蛋白質(zhì)時，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時，如果重組蛋白帶有標(biāo)簽，標(biāo)簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標(biāo)簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發(fā)生的可能性（而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間）。

4、4、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別？

答:抗體可能對封閉劑敏感，一般來講，BSA會產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因為BSA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應(yīng)。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因為牛奶含有更多種類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

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