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項目介紹

通過轉(zhuǎn)錄組學的研究以揭示生物學現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機制是高通量組學研究的一個常用策略。利用高通量測序技術(shù)在全面快速得到基因表達譜的同時，還可以通過測定的序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的SNP、可變剪接等序列及結(jié)構(gòu)變異。

技術(shù)特點

1.除了計算基因的表達水平，更可以檢測轉(zhuǎn)錄本的序列和構(gòu)變異。

2.測序深度的增加可以獲得更廣的動態(tài)檢測范圍，能夠同時鑒定和定量高豐度轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本，信號強度的跨度可達6個數(shù)量級。

3. 除了檢測已知轉(zhuǎn)錄本的表達水平外，還能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。

4. 在應用于尚無參考基因組的物種時，可以通過從頭組裝發(fā)現(xiàn)新基因。

實驗流程

圖中深色為該實驗流程

分析流程

標準分析

（1）數(shù)據(jù)過濾及比對分析

（2）轉(zhuǎn)錄本拼接

高級分析

（3）差異表達基因篩選

（4）差異表達基因聚類分析

（5）使用GO/KEGG分析，推測突變基因富集在哪些代謝通路。

樣品要求

樣本要求

RNA濃度≥20ng/ul ，總量≥2ug

細胞數(shù)≥5X10⁶

項目案例

常見問題

1、真核轉(zhuǎn)錄組常規(guī)建庫流程

1）通過磁珠和mRNA的polyA結(jié)構(gòu)將mRNA分離出來；

2）mRNA片段化；

3）mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈結(jié)構(gòu)，第二鏈cDNA合成時，其中的堿基T，被替換成U，從而達到鏈特異性文庫的目的；

4）5’末端修復、3’末端加A；

5）加接頭；

6）選擇特異長度回收，一般為300bp；

7）PCR；

8）上機測序。

2、原核轉(zhuǎn)錄組測序用到哪些試劑？

1）RNA提?。篢rizol Reagent；

2）核糖體RNA去除：IlluminaRibo-Zero? Magnetic Kit；

3）文庫構(gòu)建：IlluminaTruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit；

4）上機測序IlluminaNextSeq?500 High Output Kit v2。

3、什么是小RNA測序？

Small RNA測序，研究某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的已知SmallRNA，也可發(fā)現(xiàn)新的或該物種的Small RNA并預測其靶基因，為研究Small RNA的功能及此物種的基因調(diào)控機制提供了有力工具。Small RNA主要包括微RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、與piwi相互作用的RNA（piRNA）三類。

4、哪些物種可以研究lncRNA？

要做lncRNA分析，對物種有以下要求：

a. 物種為真核生物；

b. 物種具有參考基因組；

c. 具有較為完整的注釋。

5、為什么CircRNA測序的研究比較熱？

1）多角度闡述分子生物學問題的需要；

2）從新的角度發(fā)現(xiàn)導致樣本存在差異的需要；

3）尋找影響疾病發(fā)生的分子標記；

4）探究circRNA的未知功能；

5）尋找導致microRNA表達發(fā)生變化的機理。

6、全轉(zhuǎn)錄組測序是怎么做的？

全轉(zhuǎn)錄組測序是將樣品分為兩份，構(gòu)建2個文庫，1個小RNA文庫（包含miRNA）和一個去除核糖體的鏈特異性文庫（包含mRNA，lncRNA，和circRNA），然后分別上機測序，最后主要獲得4類RNA——miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA的序列信息。

學術(shù)文章

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