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一文解讀等溫量熱滴定儀 || 生物熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)研究新技術(shù)

來源：時(shí)間：2025-03-07 10:17:55 瀏覽：5702次

提起熱分析技術(shù)，大家最先想起的必然是熱重分析/差熱分析/差示掃描量熱法“三巨頭”，這三種熱分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于材料、物理、化學(xué)等領(lǐng)域的研究中。然而再經(jīng)典的測試技術(shù)總有鞭長莫及的地方，分析技術(shù)的空白需要源源不斷的新技術(shù)來填充。今天，小GO就給大家介紹一種主要用于生物學(xué)領(lǐng)域研究的微量熱儀器——等溫量熱滴定儀（isothermal titration calorimetry，ITC）。ITC可以通過檢測樣品池補(bǔ)償功率的變化，以參加反應(yīng)的物質(zhì)總濃度變化和反應(yīng)的熱量變化為函數(shù)，并結(jié)合一定的數(shù)學(xué)模型獲取熱力學(xué)參數(shù)。一次ITC實(shí)驗(yàn)即可計(jì)算出結(jié)合常數(shù)（KA）、解離常數(shù)（KD）、結(jié)合化學(xué)計(jì)量比（Δn）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）等熱力學(xué)參數(shù)。高靈敏度、高自動(dòng)化的等溫量熱滴定儀能夠原位、在線和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息，是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要方法。

圖1 等溫量熱滴定儀^[^1]

1. 工作原理

在ITC儀中，有兩個(gè)加樣池，一個(gè)是含有水的參比池，另一個(gè)是包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的樣品池，二者之間通過一個(gè)熱電偶回路相連，確保樣品池和參比池處于完全相同的溫度（圖2a）。樣品池和參比池側(cè)分別有一個(gè)加熱器，在實(shí)驗(yàn)過程中分別對(duì)樣品池和參比池進(jìn)行加熱，實(shí)驗(yàn)過程中加熱器的功率補(bǔ)償會(huì)被同步記錄下來并用于后續(xù)的熱分析，具體的操作流程如下：

① 在參比池中加入?yún)⒈任?，將反?yīng)物置于樣品池中，將參比池和樣品池設(shè)置為所需的實(shí)驗(yàn)溫度；

② 將含有配體的滴定劑（通常是小分子）裝入注射器并加入樣品池，一系列的小份配體等分試樣被依次注入到目標(biāo)反應(yīng)物的蛋白質(zhì)溶液中；

③ 樣品與滴定劑發(fā)生吸熱/放熱反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致樣品池與參比池的溫差發(fā)生變化，反應(yīng)變化的能量被熱敏裝置靈敏的檢測到，靈敏度可達(dá)到百萬分之一攝氏度；

④ 每注入一份配體滴定劑后，量熱儀都會(huì)進(jìn)行一次測量，所測得的熱量與反應(yīng)結(jié)合量成正比；

⑤ 以放熱反應(yīng)為例，注入配體后與樣品發(fā)生反應(yīng)，樣品池的溫度高于參考池，儀器記錄下降峰信號(hào)，加熱裝置對(duì)參考池供給更多的熱量，等到兩側(cè)溫度恢復(fù)一致之后，信號(hào)峰就返回到起始位置；

⑥ 經(jīng)過一系列配體注射，配體和樣品之間的摩爾比逐漸增加，樣品中的活性成分越來越少，反應(yīng)結(jié)合量減少，每注入一份配體后的熱量變化也在減小，直到最終樣品池中的樣品飽和，熱量變化趨近為零；

⑦ 等溫量熱滴定儀將一系列的變化數(shù)值記錄下來，即可獲得量熱曲線（圖2b）；

⑧ 將每個(gè)峰的面積進(jìn)行積分，并以配體與樣品的摩爾比為橫坐標(biāo)進(jìn)行繪圖，生成的等溫線（熱量峰曲線，圖2c）可用于擬合計(jì)算得出焓ΔH，結(jié)合擬合方程可獲得親和力K_D，結(jié)合等溫線中心的摩爾比可以獲得反應(yīng)化學(xué)計(jì)量數(shù)。

圖2 等溫量熱滴定儀工作原理^[^3]

1.1 量熱滴定or滴定量熱？

ITC的中文名主要有“等溫量熱滴定儀”和“等溫滴定量熱儀”兩種，這是根據(jù)它的測試原理和流程命名的。總的來看，ITC的測試流程主要分為兩部分：功率補(bǔ)償和譜圖分析。ITC的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以熱譜圖形式表示，它提供了有關(guān)反應(yīng)中物質(zhì)的量(滴定終點(diǎn))和反應(yīng)物質(zhì)的特性(變)的數(shù)據(jù)。對(duì)圖進(jìn)行分析，可以得知反應(yīng)容器中發(fā)生的反應(yīng)的類型和數(shù)目，以及溶液中存在的各物種的濃度等信息。這部分內(nèi)容稱為熱滴定。同時(shí)還可以確定反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，計(jì)算反應(yīng)的熱力學(xué)量如平衡常數(shù)K(ΔG°)、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的焓變?chǔ)°和熵變?chǔ)°這部分內(nèi)容稱為滴定量熱法^[^4]。

1.2 為什么可以用微量熱法研究分子間相互作用？

分子間相互作用過程中價(jià)鍵的形成和破壞需要釋放或者吸收能量，絕大部分化學(xué)和生化過程也都伴隨著熱量的吸收和釋放，這是ITC儀測試分析的根本原理。微量熱檢測的是最基本、最普遍的物理量-熱量變化，這是ITC儀的測試原理。儀器靈敏度的提高讓檢測mcal或者ncal水平的熱量成為可能，樣品的用量也隨著儀器設(shè)計(jì)的進(jìn)步而減少到可以接受的程度，這是ITC儀實(shí)現(xiàn)微量研究的原理。被分析的樣品始終處于天然的溶液狀態(tài)和構(gòu)象，無需修飾。測試過程非光學(xué)檢測，樣品顏色、內(nèi)在熒光、透明度對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有影響。熱量測定可以在廣泛的溶液環(huán)境和溫度條件下進(jìn)行，這是ITC儀能對(duì)廣泛的樣品進(jìn)行測試分析的原理。

2. 樣品制備要求

(1) 緩沖液要求

a. 為了降低背景熱，實(shí)驗(yàn)需要的兩種分子的緩沖液必須一致；

b. DMSO的稀釋熱非常高，因此需要樣品池與滴定針里的DMSO濃度高度一致；

c. pH值的微小差異也會(huì)引起很高的稀釋熱，因此建議提前用透析液稀釋樣品；

d. 還原劑會(huì)引起顯著的基線漂移和假陽性，特別是當(dāng)焓變很小的時(shí)候。可用TCEP代替β-Me和DTT，濃度盡可能的低于1mM；

e. 建議提前對(duì)緩沖液脫氣，可有效減少氣泡，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

(2) 樣品要求

a. 一次實(shí)驗(yàn)需要的體積：≥ 350 μL 蛋白（樣品池）；≥ 60 μL 配體（滴定針）；

b. 可嘗試的初始濃度：5-50 μM 蛋白 (至少 10x Kd)；50-500 μM 配體 (≥10x 樣品池濃度)；

c. 測試前要對(duì)樣品做離心或過濾處理，并精確測定樣品的摩爾濃度。

(3) 減少誤差

a. 樣品池中的濃度誤差會(huì)影響 stoichiometry，滴定針中的濃度誤差會(huì)直接影響K_D，ΔH和n；

b. Protein aggregates 會(huì)干擾ITC實(shí)驗(yàn)；

c. 可用光散射評(píng)價(jià)蛋白的均一性，純化的蛋白樣品如果有可溶性的聚集可以通過 size-exclusion chromatography 去除；

d. 試驗(yàn)前后要使用緩沖液對(duì)裝樣針、樣品池、參比池進(jìn)行潤洗。

(4) 樣品前處理

a. 準(zhǔn)備約50mL的緩沖溶液（用來潤洗樣品池及注射器，或者實(shí)驗(yàn)結(jié)束后先用緩沖溶液清洗樣品池）；

b. 將樣品（滴定物和被滴定物）及上述的緩沖溶液一起放入degassing station 脫氣處理；

c. Degassing station 設(shè)置溫度（測試滴定實(shí)驗(yàn)溫度），真空度400mmHg以上，脫氣時(shí)間10min。

3. 應(yīng)用范圍

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(包括抗原-抗體相互作用和分子伴侶-底物相互作用)；蛋白質(zhì)折疊/去折疊；蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及酶-抑制劑相互作用；酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；藥物-DNA/RNA相互作用；RNA折疊；蛋白質(zhì)-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-細(xì)胞相互作用^[^5]。

4. 技術(shù)優(yōu)勢

1) 無需標(biāo)記：直接測定最普遍的熱量變化，無需通過熒光標(biāo)記或固定化技術(shù)對(duì)結(jié)合配偶體進(jìn)行修飾；

2) 在一次ITC實(shí)驗(yàn)中可以獲得有關(guān)結(jié)合反應(yīng)的大量信息，有助于了解相互作用的性質(zhì)并探索其熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)因素；

3) 非特異性：基本上兼容任何緩沖或添加劑。測溫滴定法以熱效應(yīng)為基礎(chǔ)，與溶液的許多性質(zhì)(如粘度、光學(xué)透明度、介電常數(shù)、溶劑強(qiáng)度、以及離子強(qiáng)度等)無關(guān)，因此可以用于氣相、液相非水溶液、有色溶液、膠體溶液和粘稠漿狀等體系，對(duì)被研究體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件；

4) 樣品用量小，方法靈敏度和精確度高。儀器最小可檢測熱功率2 nW，最小可檢測熱效應(yīng)0.125 μJ，生物樣品最小用量0.4 μg，溫度范圍2 - 80 ?C，滴定池體積小(1.43 ml)；

5) 響應(yīng)速度快，測試時(shí)間短：一次實(shí)驗(yàn)時(shí)間只需30-60分鐘；

6) 操作簡便：整個(gè)實(shí)驗(yàn)由計(jì)算機(jī)控制，使用者只需輸入實(shí)驗(yàn)的參數(shù)，如溫度注射次數(shù)、注射量等，計(jì)算機(jī)就可以完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)，再由Origin軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù)，易上手，人工誤差?。?/p>

7) 無損性：測量時(shí)不需要制成透明清澈的溶液，而且量熱實(shí)驗(yàn)完畢的樣品還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析；

8) 非特異性：生物體系本身具有特異性，因此ITC這種非特異性方法有時(shí)可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律，特別適應(yīng)于研究生物體系中的各種特異過程。

5. 應(yīng)用范例

(1) ITC研究蛋白質(zhì)-酶的相互作用

纖維素是地球上最豐富的可再生性自然資源，木質(zhì)纖維材料生物質(zhì)的全利用是對(duì)于人類來說最為重要的生物技術(shù)之一。纖維素酶現(xiàn)在已經(jīng)被越來越多的應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，特別是去垢劑中的應(yīng)用，因此研究去垢劑和纖維素酶的相互作用及其在去垢劑中的穩(wěn)定性影響就顯得尤為重要。武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的研究者們^[6]采用特異性的熒光滴定法結(jié)合非特異性的ITC測試法，對(duì)陰離子型去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和綠色木霉纖維素酶的相互作用進(jìn)行了研究。

15 ?C下SDS和纖維素酶結(jié)合的ITC曲線和由此擬合的非線性擬合曲線如圖3所示。從圖3a可以看出，SDS與纖維素酶的結(jié)合反應(yīng)為放熱反應(yīng)，隨著SDS濃度從0.35 mmol/L增大到8.2 mmol/L，結(jié)合反應(yīng)趨于飽和，滴定曲線逐漸減小。采用獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)模型模擬出該過程的本征結(jié)合常熟、本征摩爾結(jié)合焓和纖維素酶的SDS結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為K_b=126±23 L/mol，Δ_bH⁰_m=-3.49±0.24 kJ/mol和n=42.5±0.7。

不同溫度下SDS和纖維素酶結(jié)合的熱力學(xué)數(shù)據(jù)列在表1中。從測試結(jié)果也可以看出，隨著溫度的升高，K_b總體上是下降的，但30 ?C的K_b反而比25 ?C的數(shù)據(jù)稍大，這可能是由于SDS結(jié)合纖維素酶的親和力較弱。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SDS結(jié)合綠色木霉纖維素酶的親和力較弱，為較小的放熱反應(yīng)，并伴隨著一定程度的熵增，屬于焓和熵共同驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)。該結(jié)合過程的焓變和熵變強(qiáng)烈地依賴于溫度，但其Gibbs自由能幾乎與溫度無關(guān)，表明該結(jié)合過程中存在著顯著的焓-熵補(bǔ)償作用。

圖3 SDS與綠色木霉纖維素酶結(jié)合的ITC曲線

表1 SDS與綠色木霉纖維素酶結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

（2） ITC研究糖-蛋白質(zhì)相互作用

核糖開關(guān)(riboswitch)是位于mRNA非編碼區(qū)域的RNA元件，可與小分子配體結(jié)合導(dǎo)致結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。核糖開關(guān)aac能夠特異性結(jié)合氨基糖苷類抗生素，從而調(diào)控氨基糖苷類抗生素抗性基因的表達(dá)。目前，核糖開關(guān)aac與氨基糖苷類抗生素相互作用的位點(diǎn)和機(jī)制尚不清楚。復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院的研究者們使用ITC法對(duì)核糖開關(guān)aac與氨基糖苷類抗生素的結(jié)合親和力及結(jié)合熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，并初步討論了點(diǎn)突變對(duì)相互作用的影響^[^7]。

RNA與小分子的相互作用需要合適的構(gòu)象，因此，進(jìn)行等溫滴定實(shí)驗(yàn)前需將RNA進(jìn)行退火處理。實(shí)驗(yàn)前RNA溶液在95 ?C變性5 min，金屬浴退火4 h，滴定樣品須在4 ?C下12000 r/min離心10 min去除氣泡，隨后再進(jìn)行ITC實(shí)驗(yàn)，獲得的補(bǔ)償功率隨時(shí)間變化的曲線圖和反應(yīng)熱隨摩爾比變化的曲線圖如圖4所示。

圖4 ITC反應(yīng)中補(bǔ)償功率隨時(shí)間變化的曲線圖和反應(yīng)熱隨摩爾比變化的曲線圖

圖中，鏈霉素滴定核糖開關(guān)aac的反應(yīng)熱曲線呈散點(diǎn)狀，表明鏈霉素不能結(jié)合核糖開關(guān)aac，西索米星、慶大霉素、G418、奈替霉素、巴龍霉素與核糖開關(guān)aac有特異性相互作用；阿米卡星、卡那霉素A、鏈絲菌素、鏈霉素、新霉素、新霉胺、核糖霉素與核糖開關(guān)aac沒有特異性相互作用。對(duì)反應(yīng)熱函數(shù)用One Set of Sites模型(圖2中黑色實(shí)線)進(jìn)行擬合，得到結(jié)合反應(yīng)的焓變、熵變、結(jié)合常數(shù)和化學(xué)計(jì)量比，結(jié)果表明在與核糖開關(guān)aac特異性結(jié)合的五種氨基糖昔類抗生素中，奈替霉素與核糖開關(guān)aac的結(jié)合親合力最強(qiáng)，為1.68 μmol/L；巴龍霉素與核糖開關(guān)的結(jié)合親合力最弱，為13.02 μmol/L。

根據(jù)結(jié)合熱力學(xué)和核糖開關(guān)aac的二級(jí)結(jié)構(gòu)推斷，核糖開關(guān)aac與氨基糖昔類抗生素的結(jié)合發(fā)生在A18和U68之間，核糖開關(guān)aac中的A13和A44也影響核糖開關(guān)aac與氨基糖昔類抗生素的結(jié)合。這些結(jié)果對(duì)進(jìn)一步研究核糖開關(guān)aac與氨基糖苷類抗生素相互作用的位點(diǎn)和機(jī)制具有重要的參考價(jià)值。

6. 總結(jié)

等溫滴定量熱法（ITC）是一項(xiàng)可實(shí)時(shí)、定量、在線和動(dòng)態(tài)描述反應(yīng)過程的熱分析技術(shù)，能夠給出主客體相互作用的結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)、結(jié)合化學(xué)計(jì)量比、焓變和熵變等熱力學(xué)參數(shù)。該技術(shù)具有量熱靈敏度高、測量準(zhǔn)確、適用范圍廣、非特異性等優(yōu)點(diǎn)，可以研究小分子-蛋白質(zhì)作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等生物學(xué)及藥學(xué)反應(yīng)特性，廣泛用于研究臨床用藥相容性、DNA/RNA變異特性、藥物制劑等領(lǐng)域。由于ITC的測量依據(jù)是檢測的是最基本、最普遍的物理量-熱量變化，因此檢測準(zhǔn)確性高，而且儀器檢測靈敏度高，是生物學(xué)領(lǐng)域最有效的測試分析方法之一。

參考資料

[1] http://www.5g2a.com/sycs/714.html

[2] http://www.5g2a.com/article/11243.html

[3] https://www.bilibili.com/video/av96496262/

[4] 齊心潔，王玥，王彥晟，方國康，黃迎春.等溫滴定量熱法在蛋白質(zhì)-配體相互作用中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2017，33(05): 40-49. DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.006.

[5] 葛秀杰，高雅，李德興，葛廣路.等溫滴定量熱儀的校準(zhǔn)方法與程序?qū)崿F(xiàn)[J].儀器儀表學(xué)報(bào)，2021，42(02): 1-9. DOI:10.19650/j.cnki.cjsi.J2006807.

[6] 項(xiàng)瑾，梁毅，陳楠.等溫滴定量熱法和熒光滴定法研究十二烷基硫酸鈉與纖維素酶的結(jié)合[J]. 化學(xué)學(xué)報(bào)，2003(12): 1949-1954.

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