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技巧分享：免疫電鏡測(cè)試的樣本制備要點(diǎn)
來源： 時(shí)間：2024-08-02 09:30:35 瀏覽：3080次

技巧分享：免疫電鏡測(cè)試的樣本制備要點(diǎn)

 

免疫電鏡測(cè)試（Immunoelectron Microscopy，簡稱IEM）是一種高精度的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，結(jié)合了電子顯微術(shù)和免疫標(biāo)記技術(shù)，用于在納米級(jí)別觀察細(xì)胞、組織及生物大分子的超微結(jié)構(gòu)；該技術(shù)因其高分辨率和強(qiáng)大的穿透力，在生命科學(xué)研究中扮演著重要角色。

以下將詳細(xì)介紹免疫電鏡測(cè)試的樣本制備要點(diǎn)：

一、樣本的選擇與固定

1. 樣本選擇：選擇新鮮、無污染的樣本是成功制備免疫電鏡樣本的前提；對(duì)于不同類型的樣本，如細(xì)胞、組織切片或病毒顆粒，需采用不同的處理方法。

2. 固定劑的選擇：常用的固定劑有戊二醛和多聚甲醛；戊二醛適用于固定細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu)，多聚甲醛則更適用于抗原定位。

3. 固定過程：固定時(shí)需注意固定劑的濃度、溫度和固定時(shí)間；通常，4%戊二醛在4°C下固定過夜效果最佳。

二、脫水與滲透

1. 脫水：脫水是樣本制備的關(guān)鍵步驟，通常使用乙醇或丙酮系列進(jìn)行脫水；每級(jí)脫水時(shí)間不宜過長，以免樣本變形。

2. 滲透：滲透劑常用環(huán)氧樹脂或聚二甲基硅氧烷（PDMS）；滲透過程中需注意溫度和時(shí)間，確保樹脂充分滲透到樣本內(nèi)部。

三、包埋與切片

1. 包埋：將滲透好的樣本包埋在環(huán)氧樹脂中，然后進(jìn)行聚合；聚合過程中需控制溫度和時(shí)間，以保證樹脂充分聚合。

2. 切片：使用超薄切片機(jī)切取50-70nm的切片，切片應(yīng)無皺褶、無刀痕。

四、免疫標(biāo)記

1. 抗體選擇：選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體是免疫標(biāo)記成功的關(guān)鍵；一抗和二抗需經(jīng)過驗(yàn)證，確保其可靠性。

2. 標(biāo)記方法：常用的免疫標(biāo)記方法有免疫金標(biāo)記和免疫鐵標(biāo)記；免疫金標(biāo)記具有更高的分辨率和靈敏度。

3. 標(biāo)記過程：標(biāo)記過程中需注意抗體稀釋度、孵育時(shí)間和溫度；通常，4°C下孵育過夜可獲得較好效果。

五、后處理與觀察

1. 后處理：免疫標(biāo)記后的切片需進(jìn)行后處理，如清洗、干燥和染色；常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。

2. 觀察：將處理好的切片置于透射電鏡下觀察；觀察時(shí)需調(diào)整電壓、電流和聚焦，以獲得清晰的圖像。

六、常見問題與解決方法

1. 樣本脫落：可能由于脫水、滲透不充分或切片過厚；解決方法為優(yōu)化脫水、滲透步驟，切取適當(dāng)厚度的切片。

2. 免疫標(biāo)記不清晰：可能由于抗體濃度不當(dāng)、孵育時(shí)間不足或樣本固定不良；調(diào)整抗體濃度、延長孵育時(shí)間或優(yōu)化固定步驟可改善。

3. 背景染色過深：可能由于染色時(shí)間過長或染色劑濃度過高；適當(dāng)縮短染色時(shí)間或降低染色劑濃度可減輕背景染色。

4. 切片皺褶或撕裂：可能由于切片過厚、刀片不鋒利或操作不當(dāng)；切取適當(dāng)厚度的切片，確保刀片鋒利，操作時(shí)輕柔、穩(wěn)定。

 

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