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蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB）的常見問(wèn)題分析

來(lái)源：測(cè)試GO 時(shí)間：2022-09-07 14:16:01 瀏覽：4548次

1、蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中蛋白樣本為什么要進(jìn)行還原和變性？

答：為了使樣本被還原和變性，樣品緩沖液中會(huì)含有十二烷基硫酸鈉(SDS)和β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。SDS是一種變性劑，用來(lái)打破蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，變成初級(jí)的氨基酸結(jié)構(gòu)，同時(shí)以恒定的質(zhì)量比包被蛋白質(zhì)，使其帶上負(fù)電荷。這一恒定的負(fù)電荷比是下一步凝膠電泳分離的關(guān)鍵。β-巰基乙醇和DTT都是還原劑，用來(lái)斷開蛋白自身的二硫鍵，進(jìn)一步使蛋白質(zhì)變成線性結(jié)構(gòu)，此圖中簡(jiǎn)單地展示了這一過(guò)程。順便提一下，有些抗體只能夠識(shí)別目標(biāo)蛋白的天然結(jié)構(gòu)，在這種情況下，樣本不需要被還原和變性。所以還原和變性的步驟可以省略。但是，大多數(shù)蛋白質(zhì)印跡分析都需要在還原和變性的體系中進(jìn)行。

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)圖片

2、為什么檢測(cè)重組蛋白時(shí)難以獲得條帶？

答：抗體檢測(cè)重組蛋白質(zhì)時(shí)，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。所以推薦確保樣品中表達(dá)的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。同時(shí)，如果重組蛋白帶有標(biāo)簽，標(biāo)簽可能阻止抗體接近表位。盡可能讓標(biāo)簽位于重組蛋白的C或N末端，以降低這種情況發(fā)生的可能性（而不是位于蛋白質(zhì)的閱讀框中間）。

3、牛奶和 BSA 封閉有區(qū)別？

答:抗體可能對(duì)封閉劑敏感，一般來(lái)講，BSA會(huì)產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，因?yàn)?/span>BSA含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發(fā)生交叉反應(yīng)。但并非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因?yàn)榕Ｄ毯懈喾N類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質(zhì)。

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